实验的每一小步，都是决定结果的一大步。本期将为大家拆分IHC/ICC的实验步骤，分析每一步对结果的影响，喜欢的话就继续往下看吧！

样品准备

组织和细胞样品必须经正确地收集和处理之后才能用于IHC/ICC研究。为了便于孵育，必须将组织切成超薄的切片（5-10μm）或切成小块用于 whole mount IHC。若是做ICC实验，在染色之前必须将细胞吸附在玻片上。样品准备的方法取决于固定的方法,而固定的方法又受所要使用的检测技术的影响（荧光或显色）。在多数情况下，通过单个实验变量可以确定最合适的样品准备法。例如，用甲醛浸润固定的组织必须经石蜡包埋并用显微切片机切成薄片。如果检测磷酸化依赖型的表位，需要将组织速冻并在低温恒温器中进行切片，然后醇固定。

• 石蜡包埋组织

 *图片来源于丁香通

若要长期保存组织样品，石蜡包埋是最佳选择。在包埋之前必须先固定组织。可以在组织剥离之后立即用灌流或浸润的方法固定，通常需要4-24小时。不建议固定超过24小时，因为过度固定会导致抗原被遮蔽起来。如果不能立即包埋，可以将固定后的组织置于乙醇中暂时保存。

因为石蜡不透水，所以在加入熔解的石蜡前必须先将组织脱水。脱水可以通过将组织在浓度递增的乙醇中浸泡来实现。这一方法提供逐渐变化的疏水环境，使细胞受到的损伤降到最低。脱水之后，将组织在甲苯中孵育以除去残留的乙醇。通常用加热到60℃的的石蜡包埋并冷却过夜。再用锋利的刀片在显微切片机中将组织切成薄片。之后将切片置于玻片上干燥，干燥后的切片可以在室温下保存。在进行IHC/ICC操作之前，必须先将组织切片再水化。石蜡是最廉价、使用最普遍的一种组织包埋剂。也可以用朔料包埋组织，这样硬度更高,可以切成更薄的切片(1.5μm vs. 5μm)。

• 冰冻组织

*图片来源于网络

冰冻组织样品的好处之一是可以省去石蜡包埋之前的固定步骤，节约了时间。对于检测翻译后修饰如磷酸化，速冻尤其具有优势。将组织浸润在液氮或液态的异戊烷中，或埋在干冰中处理，以得到冰冻组织样品。在冰冻和切片之后可以对样品进行短暂的固定。最常用的固定剂是乙醇，使用乙醇固定可以避免表位被甲醛交联，无需进行抗原修复。在冷冻恒温箱内将冰冻组织切片，切片可以在-80℃保存最多一年。

冰冻组织切片的处理过程比石蜡包埋切片快捷。但是,要长期保存组织，冰冻是不够的，而且冰晶的形成可能会破坏亚细胞结构。此外，冰冻切片通常比石蜡切片更厚。因为冰冻组织中的酶仍然具有活性，封闭可能会影响IHC监测的酶的活性就显得尤其重要。

IHC样品准备比较

• 细胞样品

为了进行ICC研究，必须将细胞吸附在固体支持物上，如显微镜的载玻片或盖玻片。对于贴壁细胞，这很简单，可以让其直接生长在铺在6孔或24孔板里的高级别、无菌盖玻片上。在盖玻片上预包被上带电多聚物如多聚L赖氨酸和/或胞外基质蛋白如层黏蛋白、纤粘蛋白或胶原可以增强细胞粘附。通过在每个孔中加入或吸取相应的溶液，所有的染色操作都可以在微孔板上进行。通过Cytospin离心或在包被了多聚L赖氨酸的玻片上孵育10分钟，悬浮细胞也可以粘附在玻片上。

注意：辨别样品准备不好造成的人为因素的影响对于正确解释实验结果很重要。例如，组织的褶皱或裂缝，或组织/细胞核玻片之间的气泡会引起染色试剂的非特异性聚集并造成假阳性结果，使阳性染色难以区分。

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