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01支原体简介

支原体( Mycoplasma)属于柔膜体纲，是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞微生物，是已知最小的自我复制的原核生物。能通过滤菌器，大小为0.1～0.3微米。

支原体广泛存在于人和动物体内，大多不致病，对人致病的支原体主要有肺炎支原体、溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体等。

支原体是细胞污染物中比较常见的一种，细胞受支原体污染程度较轻时，不会表现出明显的症状，可是一旦这种潜伏的污染爆发时，细胞会大量脱落，细胞培养液会变浑浊。

支原体污染可能来自操作人员和细胞培养用原材料，如血清和胰蛋白酶，也可能来自于本身已被污染的细胞系和毒种。细胞受支原体污染后，功能和活性都会受到影响，会带来不可靠的实验结果和不安全的细胞制品，因此对细胞进行支原体检测十分关键。

02支原体检测相关法规概览

支原体检测属于监管要求的一部分，支原体检测方法在全球范围内的一些药典、法规和指导文件中均有说明。针对生物制药产品支原体检测的检测指导方针包括以下内容：

• 中国药典2020版三部：生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制

• 中国药典2020版三部：3301 支原体检查法

• 欧洲药典 2.6.7：Mycoplasmas

• 美国药典 <63>：Mycoplasma Tests

法规要求必须证明用于生物制品生产的细胞基质不含外源因子，包括支原体。支原体污染检测必须在产品开发的各个阶段进行，包括原材料、细胞、病毒种子库、未加工的收获液材料和最终产品。

ATCC支原体菌株

在中国药典2020版三部：3301 支原体检查法中，明确标明了支原体检测时使用的菌株为ATCC来源的菌株，产品信息如下：

03支原体检测方法

1、分离培养法

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• 分离培养法是支原体检测的金标方法，其检测精确度最高；

• 这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，最终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准；

• 不过分离培养法也存在两个弊端，一是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候，例如支原体M. hyorhinis。

2、DNA检测（荧光染色）

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• DNA检测需要将可疑样品与指示细胞共同培养，因此一般需要几天时间；

• DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞，如果原样本中含有支原体，那么当细胞DNA被荧光染料（如Hoechst染料）染色时，就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒；

• 分离培养法用来检测支原体M. hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以准确的将其检测出来。

3、PCR法

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• PCR法也可以检测M. hyorhinis菌株，PCR法检测支原体只需几个小时，是最快但也是最不灵敏的支原体检测方法；

• 该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本，其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体，但谨慎起见最好同时使用另一种检测方法来进行验证。

ATCC广谱支原体检测试剂盒：

ATCC广谱支原体检测试剂盒---来自于细胞培养专家ATCC，用PCR方法，对支原体DNA进行常规检测的试剂盒。

这个试剂盒中包含了可以结合16SrRNA基因的广谱PCR引物，并通过降落PCR（touch down PCR）方法提高试剂盒的灵敏度，且用特异性的耐热DNA聚合酶来提高试剂盒的特异性。这种方法符合欧洲药典2.6.7的标准 (Biologicals38,March 2010)

更多产品相关产品信息可参考ATCC网站：

https://www.atcc.org/search#q=Mycoplasma%20&sort=relevancy&numberOfResults=24

订购热线：010-84415766；

邮箱：atcc@sinozhongyuan.com